把東西放大并不難，難的是放大之后還能看清細(xì)節(jié)。這兩個(gè)目標(biāo)并不總是一致——把一張模糊的照片拉大，只會(huì)得到一張更大的模糊照片。顯微鏡的設(shè)計(jì)，很大程度上就是在與這個(gè)矛盾打交道。

它的成像分兩步：物鏡先把樣品的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨出來，形成一個(gè)中間像，再由目鏡或相機(jī)把這個(gè)像放大。決定「能看多細(xì)」的是前一步，決定「看起來多大」的是后一步，兩者的關(guān)鍵指標(biāo)并不相同。

一、放大倍數(shù)大，不等于看得更清

設(shè)想樣品上有兩個(gè)靠得很近的點(diǎn)。如果物鏡分辨能力不足，這兩個(gè)點(diǎn)在中間像上就已經(jīng)糊成了一個(gè)斑，后面無論怎么放大，都只能看到一個(gè)更大的斑——信息在第一步就已經(jīng)丟了。

圖1：倍數(shù)與分辨率不是一回事

真正決定細(xì)節(jié)的是分辨率，它由光的波長與物鏡的收集能力共同決定：波長越短、收集角度越大，能分辨的兩點(diǎn)間距就越小。把已經(jīng)分辨出的細(xì)節(jié)放大才有意義，把模糊的像放大只得到更大的模糊。

選購時(shí)常被忽略三件事。有效放大倍數(shù)有上限：超過分辨率能支撐的倍數(shù)后再放大，不會(huì)有新信息出現(xiàn)。數(shù)值孔徑比倍數(shù)更關(guān)鍵，它決定了能收集多少衍射光。照明也影響結(jié)果，照明方式不合適，再好的物鏡也發(fā)揮不出來。

有效放大倍數(shù)有一個(gè)經(jīng)驗(yàn)范圍，大致是數(shù)值孔徑的五百到一千倍。低于下限-時(shí)細(xì)節(jié)已經(jīng)分辨出來卻沒被放大到肉眼可辨，高于上限則只是把模糊拉大。這也是為什么高倍觀察常要配高數(shù)值孔徑物鏡——兩者得匹配。

二、數(shù)值孔徑是什么，為什么它關(guān)鍵

樣品上每一點(diǎn)發(fā)出的光會(huì)向各個(gè)方向散開，物鏡只能收進(jìn)落在自己口徑內(nèi)的那一部分。收進(jìn)來的光錐越寬，參與成像的衍射光越多，細(xì)節(jié)保留得越完整。

圖2：數(shù)值孔徑與收集角

這個(gè)收集能力用數(shù)值孔徑來量，寫作 NA = n·sinθ，其中 n 是物鏡與樣品之間介質(zhì)的折射率，θ 是光錐的半角。半角越大、介質(zhì)折射率越高，數(shù)值孔徑就越大。

它與分辨率成反比：可分辨的最小間距約等于波長除以兩倍數(shù)值孔徑。因此數(shù)值孔徑翻倍，可分辨間距就減半。

這里能看出浸液的作用：同樣是那個(gè)角度，空氣的 n 約為一點(diǎn)零，水約為一點(diǎn)三三，香柏油約為一點(diǎn)五二。所以油浸物鏡能達(dá)到的數(shù)值孔徑最高，看得也最細(xì)——這就是它存在的理由。

還有一個(gè)量常被寫進(jìn)規(guī)格書卻容易被忽略：出瞳直徑。它決定了從目鏡出來的光束有多粗，也決定了眼睛在某個(gè)位置上能否看全整個(gè)視野。低倍物鏡的出瞳通常較粗，觀察起來舒適；高倍時(shí)出瞳變細(xì)，眼睛位置稍偏就會(huì)看到視野被切掉一塊。

三、物鏡為什么不只是一片透鏡

單片透鏡在高倍下?lián)尾蛔。呵虿钍惯吘壟c中心的光線不聚于同一點(diǎn)，色差使不同波長的光聚焦在不同位置。結(jié)果是像既發(fā)虛又帶彩邊。

圖3：多片組合與校正等級(jí)

實(shí)際物鏡是多片透鏡的組合，用不同形狀、不同材料的鏡片互相抵消像差。按校正程度分幾檔：消色差校正兩種色差，日常夠用、價(jià)格適中；復(fù)消色差校正三種色差，要求高時(shí)選用，價(jià)格明顯更高；平場則校正場曲，拍平面圖像時(shí)畫面才平整。

鏡筒上的標(biāo)注都在說這幾件事：放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑、工作距離（物鏡前端到樣品的距離，高倍時(shí)通常很短），以及蓋玻片厚度——多數(shù)物鏡按零點(diǎn)一七毫米設(shè)計(jì)，偏差會(huì)引入球差，高倍時(shí)尤其明顯。

鏡筒上還會(huì)標(biāo)出建議的浸液類型。油浸物鏡必須滴油才能發(fā)揮標(biāo)稱的數(shù)值孔徑，干鏡則絕不能沾油——沾了會(huì)改變前透鏡的工作條件，像質(zhì)立刻下降。用完及時(shí)清潔也是必要的，殘留的油會(huì)干結(jié)并影響后續(xù)使用。

四、樣品不染色時(shí)，靠什么產(chǎn)生對(duì)比

許多生物樣品是近乎透明的，光直接穿過去，吸收很少，明場下幾乎看不見。這時(shí)就得換照明方式。

圖4：四種照明方式

明場讓光直接透過樣品，背景亮、樣品暗，適合本身有顏色或經(jīng)過染色的樣品。暗場反過來，擋住直射光、只收集被樣品散射的光，于是背景暗、邊緣亮，適合看透明樣品的輪廓。

相差更巧妙：透明樣品不改變光的強(qiáng)度，但會(huì)改變光的相位。相差照明把這種相位差轉(zhuǎn)換成亮度差，于是不用染色也能看清活細(xì)胞，代價(jià)是圖像周圍常出現(xiàn)光暈。

第四種是熒光：先用特定波長激發(fā)，再看樣品自身發(fā)出的光。它的靈敏度高，原因有三——激發(fā)與發(fā)射波長不同可用濾光片分開；沒有標(biāo)記的地方不發(fā)熒光，背景極暗；而且可以讓標(biāo)記只結(jié)合目標(biāo)結(jié)構(gòu)，從而定位它在哪里。

還要留意兩種副作用。光漂白：熒光分子在反復(fù)激發(fā)下會(huì)逐漸失去發(fā)光能力，因此長時(shí)間觀察時(shí)信號(hào)會(huì)衰減，需要控制曝光強(qiáng)度與時(shí)間。光暈：相差成像中樣品邊緣常出現(xiàn)一圈亮環(huán)，那是相位轉(zhuǎn)換過程中的固有產(chǎn)物，容易掩蓋緊貼邊緣的細(xì)小結(jié)構(gòu)。

五、放大之后，還有哪些限制跟著來

倍數(shù)上去之后，兩個(gè)限制會(huì)立刻變得明顯。

景深——能同時(shí)看清的厚度。倍數(shù)越高，景深越薄，高倍下往往只有很薄一層是清晰的，其余都是模糊的。因此高倍觀察常需要逐層調(diào)焦，或用軟件把多層合成。

圖5：景深與工作距離

工作距離隨倍數(shù)迅速縮短：四倍物鏡可能還有近二十毫米，二十倍降到幾毫米，一百倍往往不足一毫米。高倍物鏡幾乎貼著樣品，操作時(shí)稍不注意就會(huì)碰到，這一點(diǎn)在實(shí)際使用中要特別留意。

還有幾個(gè)常見誤區(qū)值得提前避開。以為倍數(shù)越高越好——超過分辨率支撐的范圍只是把模糊放大。忽略蓋玻片厚度——厚度不符會(huì)引入球差，高倍時(shí)尤其明顯。油浸物鏡用錯(cuò)油——折射率不匹配，標(biāo)稱的數(shù)值孔徑實(shí)際達(dá)不到。照明沒調(diào)好就怪物鏡——聚光鏡與光闌的設(shè)置同樣決定成像質(zhì)量。

至于相機(jī)一側(cè)，有個(gè)匹配問題值得一提：相機(jī)的像素尺寸要與物鏡的分辨能力相稱。像素太粗會(huì)浪費(fèi)已經(jīng)分辨出的細(xì)節(jié)，像素過細(xì)則只是把同一個(gè)細(xì)節(jié)拆成更多像素，并不會(huì)帶來更多信息——這與前面談的放大倍數(shù)上限其實(shí)是同一個(gè)道理。

六、選物鏡時(shí)要看哪些參數(shù)

選型時(shí)通常在這五個(gè)參數(shù)之間權(quán)衡。

放大倍數(shù)決定看到的視野大小，常用四倍到一百倍，油浸物鏡多為六十倍以上。數(shù)值孔徑緊跟在倍數(shù)后面標(biāo)出，是分辨率的關(guān)鍵指標(biāo)，干鏡一般在零點(diǎn)一到零點(diǎn)九五，油浸可達(dá)一點(diǎn)四五。

圖6：選物鏡要看的參數(shù)

工作距離決定操作空間，隨倍數(shù)升高而迅速縮短，高倍時(shí)不足一毫米——如果需要一邊觀察一邊操作樣品，這一項(xiàng)往往比倍數(shù)據(jù)更優(yōu)先。

校正等級(jí)決定像質(zhì)與價(jià)格，從消色差到復(fù)消色差，平場另計(jì)。浸液介質(zhì)必須與物鏡設(shè)計(jì)匹配，用錯(cuò)介質(zhì)則標(biāo)稱的數(shù)值孔徑無法達(dá)到。

還有一個(gè)實(shí)用細(xì)節(jié)：齊焦距離。同一系列的物鏡通常設(shè)計(jì)成換倍后焦點(diǎn)基本不動(dòng)，切換時(shí)只需微調(diào)即可重新看清。不同廠家、不同系列的物鏡齊焦距離未必相同，混用時(shí)會(huì)明顯不便，因此整套系統(tǒng)最好選用同一系列。

七、總結(jié)

顯微鏡的成像分兩步：物鏡先分辨出細(xì)節(jié)，目鏡或相機(jī)再把它放大。決定「能看多細(xì)」的是前一步，關(guān)鍵指標(biāo)是數(shù)值孔徑；決定「看起來多大」的是后一步，指標(biāo)是放大倍數(shù)。兩者并不等價(jià)。

分辨率約等于波長除以兩倍數(shù)值孔徑，因此數(shù)值孔徑比放大倍數(shù)更能說明一臺(tái)顯微鏡的能力。

數(shù)值孔徑等于介質(zhì)折射率乘以光錐半角的正弦，油浸物鏡靠高折射率介質(zhì)獲得更高的收集能力。

倍數(shù)升高會(huì)帶來景深變薄與工作距離縮短，這兩個(gè)限制往往比倍數(shù)本身更影響實(shí)際操作。

數(shù)值孔徑與工作距離互相制約：追求高分辨率通常要接受很短的工作距離，而需要操作空間時(shí)又得在分辨率上讓步。規(guī)格書上的數(shù)值孔徑是在規(guī)定浸液介質(zhì)與蓋玻片厚度下測得的，實(shí)際使用時(shí)若這兩項(xiàng)不符，標(biāo)稱值就達(dá)不到。

還要說明的是，顯微鏡給出的是樣品在特定照明與處理方式下的像，它反映的是樣品經(jīng)過制備和標(biāo)記之后的狀態(tài)，與樣品原本的樣子之間隔著制備這一步——這一點(diǎn)在解讀圖像時(shí)值得單獨(dú)考慮。